负责人：李苗苗

一、摇床

1、什么是摇床？

生物摇床是一种常见的实验室仪器设备，主要是用于细菌培养、发酵、杂交和生物化学反应以及酶、细胞组织培养研究，在医学、生物学、

分子学、制药、食品、环境等行业应用广泛。

2、我室摇床使用规范

（1）摇床使用过程中，请勿随便调整摇床温度和转速，如有特殊需要，需找管理者协商并对其他同学做出说明，以免造成不必要损失。

（2）三角瓶和PA瓶标记要规范（菌种+时间+姓名），培养完成记得取出培养物,不要放置太久影响他人使用。

（3）在放入物品之前，务必检查物品是否放牢，瓶盖是否拧紧，确定后方可离开，防止培养物流出，烧坏摇床。取物或放入物品时要轻拿轻放，请勿损坏他人物品给他人造成不便。

（4）放入/取出物品前请关闭摇床电源，转速至0时方可操作，之后记得打开电源，待转速温度稳定之后才可离开。

（5）禁止在摇床内塞报纸，断掉的皮筋要及时清理，以免堵塞风机。

（6）摇床空，电源断。

二、温箱（生化培养箱）

1、什么是温箱

生化培养箱具有制冷和加热双向调温系统，温度可控的功能，是生物、遗传工程、医学、卫生防疫、环境保护、农林畜牧等行业的科研机构、大专院校、生产单位或部门实验室的重要试验设备，广泛应用于低温恒温试验、培养试验、环境试验等。生化培养箱控制器电路由温度传感器、电压比较器和控制执行电路组成。

2、我室温箱使用规范

（1）温箱使用过程中，请勿随便调整温度和湿度，如有特殊需要，需找管理者协商并对其他同学做出说明，以免造成不必要损失。

（2）可燃性和挥发性的化学物品切勿放入箱内，使用过程中出现异常、气味、烟雾等情况，请立即关闭电源，通知相关人员。

（3）温箱内物品要摆放整齐，温箱门一定要关严后方可离开。

（4）禁止把温箱当做烘箱用，禁止把10%SDS等放在温箱内。

（5）培养皿等标记要规范（菌种+时间+姓名），培养完成记得取出培养物,不要放置太久影响他人使用。

（6）取培养物时要小心，注意他人的平皿，以免将其碰掉。

（7）勿将平皿放在培养箱顶部。

（8）没有特殊情况，温箱不要开灯；箱内培养物品不易太多，应留有空隙，以利于箱内温度气流循环。

（9）严禁用手或其它物件碰撞、拉动箱内的控温探头，以免造成失灵。

三、电泳设备

凝胶电泳技术（琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳）

1、什么是电泳技术？

　　　　 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。

2、 电泳技术的分类:

电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。

　　自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。

　　区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。

3、琼脂糖凝胶电泳

（1）实验原理

　　琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。

DNA分子在碱性缓冲液(pH8.0-8.3)中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。

（2）琼脂糖凝胶缓冲液:

有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳:

Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E缓冲液）

Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)

Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)

TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移。

电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。

琼脂糖凝胶载样缓冲液:

载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：

增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；

使样品带有颜色便于上样操作；

其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。

上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。

溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；

（3）影响电泳迁移率的因素:

(a)DNA分子的大小

DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。

(b)凝胶的浓度

简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁移速率就越低，反之迁移速率就大。另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的ＤＮＡ片段就越小。

(c)DNA的构象

一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环

(d)使用的电压

　低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。为使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

(e)琼脂糖的种类

　包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。

(f)电泳缓冲液

溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向;溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。

(4)电泳操作步骤:

(a)琼脂糖凝胶的配置

(b)向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜（太多则电流加大，凝胶发热）。

(c)上样：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用移液枪轻轻混匀,用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝的样品孔中。

(d)盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。

　　开始使用电泳仪时要先将电压旋钮转到最小再打开开关，如电泳仪正在使用，将电压旋钮转到最小即可；条件：电压1～5v/cm；电泳时间根据自己片段大小自行确定。

(e)电泳结束后，切断电源，取出凝胶（如无他人正在使用，将电源关闭，否则，将电压调回原值）

(f)EB染胶：8-10min即可

　　溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光.

　　优点：染色操作简单；不会引起核酸的断裂；灵敏度较高。

　　缺点： EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。

(g)电泳结果分析：凝胶成像分析系统处理。

DNA电泳常见问题分析:

问题	原因		解决办法
DNA带模糊	1) DNA降解		避免核酸酶污染
	2) 电泳缓冲液陈旧		电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液
	3) 所用电泳条件不合适		电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
	4) DNA上样量过多		减少凝胶中DNA上样量
	5) DNA样含盐过高		电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
	6) 有蛋白污染		电泳前酚抽提去除蛋白
	7) DNA变性		电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
不规则DNA带迁移		1) 对于λ/Hind III片段cos位点复性		电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟
		2) 电泳条件不合适		电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液
		3) DNA变性		以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热
带弱或无DNA带		1) DNA的上样量不够		增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低
		2) DNA降解		避免DNA的核酸酶污染
		3) DNA走出凝胶		缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
		4) 对于EB染色的DNA，所用光源不合适		应用短波长（254nm）的紫外光源

DNA带缺失	1) 小DNA带走出凝胶	缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
	2) 分子大小相近的DNA带不易分辨	增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度
	3) DNA 变性	电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA
	4) DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适	在脉冲凝胶电泳上分析

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）实验原理

　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂N’N’-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引入SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分 子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

（2）优点：

(a)凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度

(b)灵敏度高，可达1mg

(c)分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶  电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体

(d)无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好

(e) 凝胶透明，有弹性，机械效能好

(f)化学性能稳定，与分离物不发生化学反应;  对pH和温度变化较稳定

（3）浓缩胶的作用：

　　 浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而电泳液（pH8.3）中的甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离胶前沿积聚。

（4）分离胶的作用：分子筛和电荷效应

　　 在pH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过蛋白质，穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来，在电位和pH值均匀的区段泳动，依MW大小得到分离。

（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳配制注意事项

(a)蛋白电泳所用的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体都是有毒性的，理论上说，配制成凝胶后形成的聚丙烯酰胺凝胶但是安全的，直接用手碰触也没有关系。但是即使是交联好的凝胶也不能保证没有任何单体分子的存在，因此，还是要注意防护。大量的动物试验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒性；此外，为生殖、发育毒性。 甲叉双丙烯酰胺，是强烈的神经毒素，对末稍神经系统有很强的破坏性。如果长时间在高浓度的丙烯酰胺环境下工作，会有手指颤动等症状。

(b)另外在配胶中使用的过硫酸铵也有一定毒性，对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性。吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等。眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤。口服引起腹痛、恶心和呕吐。长期皮肤接触可引起变应性皮炎

(c)TEMED对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有很大的破坏作用：强神经毒性

（6）考马斯亮蓝染液：

R250中的R代表Red，偏红，C45H44O7H3S2Na，MW=824。R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色。λmax=560―590nm，染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意。
G250中的G就是Green，偏绿，比考马斯亮蓝R250多二个甲基MW=854 。G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定。
λmax=590―610nm，染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。

（7）常见问题：

(a)“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

(b).“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

(c)为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

(d) 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

(e)什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

(f)提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

(g)为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7）；适当降低电压；

(h)为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配或者缓冲液量少，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b. 槽液过少；理办法：添加缓冲液；电泳槽正确装配。

(i)凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30min-1h内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 BMB

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2016.09.04